劃重點(diǎn)：細(xì)胞培養(yǎng)該如何應(yīng)對支原體污染！

更新時(shí)間：2021-10-15 | 點(diǎn)擊率：614

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)現(xiàn)，使得很多研究不必局限于在動物或人體內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)環(huán)境更為簡單，目的更為明確，如：細(xì)胞內(nèi)活動的基礎(chǔ)研究；細(xì)胞與細(xì)胞相互作用；細(xì)胞與環(huán)境間的相互作用；遺傳學(xué)與細(xì)胞轉(zhuǎn)化；細(xì)胞產(chǎn)物和分泌等等。

細(xì)胞培養(yǎng)物被支原體污染是極普遍的問題，面對支原體污染給細(xì)胞培養(yǎng)帶來的巨大難題，世界各國開始重視，并相繼建立了細(xì)胞庫，對細(xì)胞質(zhì)量進(jìn)展控制，效guo顯著，支原體污染的問題得以限制。目前已知能污染細(xì)胞的支原體有20多種以上，其中95％以上的支原體污染是口腔支原體。

支原體是目前已知一類能在無生命培養(yǎng)基上生長繁殖的最小的原核細(xì)胞微生物，分為兩個屬：一為支原體屬（Mycoplasma），有幾十個種；另一為脲原體屬（Ureaplasma），僅有一種。革蘭染色為陰性，但不易著色，一般用Giemsa染色，染成淡紫色。

支原體的污染來源

（1）細(xì)胞之間交叉污染；

（2）細(xì)胞培養(yǎng)操作人員的口腔、皮膚等；

（3）工作環(huán)境或?qū)嶒?yàn)器材的污染；

（4）培養(yǎng)基的污染。

支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)的污染、污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材帶來的污染和用來制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染。細(xì)胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個方面來預(yù)防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作；細(xì)胞培養(yǎng)和器材要保證無菌；在細(xì)胞培養(yǎng)中加入適量的抗生素。

1、支原體檢測

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記，使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號的變化和配套軟件，進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測，簡稱qPCR。

優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高、特異性強(qiáng)。

②時(shí)間短，2-3小時(shí)出結(jié)果。

③檢測結(jié)果可定量。

④操作簡便。

缺點(diǎn)：①對于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結(jié)果會出現(xiàn)假陽性。（可用培養(yǎng)法做補(bǔ)充驗(yàn)證）

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計(jì)不同），需謹(jǐn)慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。

德國MB公司生產(chǎn)的支原體qPCR檢測試劑盒（均為探針法檢測），依據(jù)操作步驟的細(xì)微差別，

分『經(jīng)典法』和『一步法』兩種。

2、環(huán)境空間消毒方案

試驗(yàn)臺、超凈臺、培養(yǎng)箱、液氮罐、移液器、門把手、電話等細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境

被支原體污染，可引起細(xì)胞的污染。應(yīng)定期對工作區(qū)域進(jìn)行消毒。

德國MB生產(chǎn)的Mycoplasma-offTM噴霧劑，或濕巾擦拭 5-10分鐘清除，對支原體、細(xì)菌、真菌、霉菌、孢子祛除確切有效。無殘留, 無腐蝕, 無致癌性，操作簡單方便。

截圖20211015090715.png

qPCR法介紹：